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Der Einfluss der Wirtszell-Interferonantwort auf die Influenza-Impfstoffproduktion in MDCK-Zellen

Claudius Seitz

ISBN 10: 3844017194 / ISBN 13: 9783844017199
Published by Shaker Verlag Mrz 2013, 2013
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Neuware - Madin-Darby canine kidney (MDCK) Zellen sind eine gängige Wirtszelllinie für die Herstellung zellkulturbasierter Influenza-Impfstoffe. Diese Zellen sind permissiv für ein breites Spektrum von Influenza-Viren und produzieren hohe Virustiter. In einer vorangehenden Proteomstudie unserer Arbeitsgruppe zeigte sich jedoch, dass Mx1 (myxovirus resistance protein 1) in Influenza-virusinfizierten MDCK-Zellen stark induziert wird. Die Induktion von Mx1 ist ein allgemein anerkannter Marker für Interferonaktivität. In der Literatur ist die Interferonantwort der Wirtszellen als starker inhibitorischer Faktor für die Influenza-Virusreplikation beschrieben. In dieser Arbeit sollte daher der limitierende Einfluss dieser Interferonantwort auf die Influenza-Virusausbeute in der MDCK-zellkulturbasierten Impfstoffproduktion untersucht werden. Als erstes wurden die Induktion von Interferon (IFN) und die nachfolgende Aktivierung des IFN-induzierten Mx1 für verschiedene Influenza-Virusstämme untersucht. Durch A/PR/8/34-delNS1 ein Virusstamm, dem der IFN-Antagonist NS1 (nonstructural protein 1) fehlt wurden IFN- und Mx1 stark induziert. Für die Impfstoffproduktion werden gegenwärtig aber Wildtypstämme oder High Growth Reassortanten verwendet, die über NS1 verfügen. Von den in dieser Arbeit untersuchen Wildtypstämmen zeigte nur PR8-NIBSC eine deutlich messbare Mx1-Aktivierung, wogegen alle anderen die IFN-Antwort nur schwach induzierten. Hohe Mengen nicht-infektiöser, 'defective interfering' Viruspartikel (DI-Partikel) im PR8-NIBSC Saatmaterial waren für die vergleichbar starke IFN-Induktion durch diesen Virusstamm verantwortlich. Wurde der Anteil DI-Partikel durch Passagieren von PR8-NIBSC bei geringer MOI (multiplicity of infection) reduziert, verringerte sich auch die IFN-Induktion. Solange also NS1-kompetente Virusstämme verwendet werden und das Auftreten großer Mengen DI-Partikel vermieden wird, ist bei der Impfstoffproduktion in MDCK-Zellen nur eine schwache Aktivierung der IFN-Antwort zu erwarten. Entsprechend sollte die IFN-Antwort die Replikation von Wildtypstämmen nur in geringem Maße hemmen. Tatsächlich verbesserte eine Unterdrückung der IFN-Antwort durch transiente Überexpression viraler IFN-Antagonisten (Influenza A/PR/8/34 NS1 oder Tollwutvirus Phosphoprotein) nur die Virusreplikation von PR8-delNS1, nicht jedoch von Wildtypstämmen. Diese Beobachtung traf für unterschiedliche MOIs zu. Von unserer Arbeitsgruppe wurden mehrere Ursachen für diesen ungewöhnlich geringen, inhibitorischen Einfluss der IFN-Antwort in MDCK-Zellen ermittelt. So zeigt diese Doktorarbeit, dass das bei der Impfstoffproduktion verwendete Trypsin (pankreatisches Trypsin aus Schweinen, Konzentration 5 BAEE U/mL bzw. 4,5 µg/mL) effektiv IFN proteolytisch abbaut und auf diese Weise die IFN-Antwort reduziert. Trypsin wird bei der Impfstoffproduktion zur Spaltung des viralen Hämagglutinins eingesetzt. Influenza-Viren sind erst nach HA-Spaltung infektiös, so dass Trypsin bei geringer MOI die Ausbreitung der Infektion in mehreren Infektionswellen auf alle verfügbaren Zellen ('multi-cycle replication') ermöglicht. In dieser Arbeit wurden bei Verzicht auf Trypsinzugabe eine stärkere IFN- und Apoptoseinduktion sowie geringere Virustiter beobachtet. Gleichzeitig verzögerte die Abwesenheit von Trypsin den Infektionsverlauf, jedoch fand trotzdem noch multi-cycle Virusreplikation statt. Eine unvollständige Infektion aller Zellen konnte daher als Ursache für die geringeren Virustiter in Abwesenheit von Trypsin ausgeschlossen werden. Dagegen verbesserte eine transiente Überexpression viraler IFN-Antagonisten in Abwesenheit von Trypsin den Titer für delNS1 deutlich. Weiterhin konnten durch eine trypsinunabhängige Beschleunigung des Infektionsverlaufs auch in Abwesenheit von Trypsin trotz stärkerer IFN-Induktion nahezu dieselben Virustiter erreicht werden wie mit Trypsin beobachtet. Entsprechend verhindert Trypsin wahrscheinlich auf zweierlei Weise einen limitierenden Einflu. Bookseller Inventory # 9783844017199

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Title: Der Einfluss der Wirtszell-Interferonantwort...

Publisher: Shaker Verlag Mrz 2013

Publication Date: 2013

Binding: Buch

Book Condition:Neu

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